Spiegazione: perché molte persone con sintomi di Covid-19 sperimentano risultati negativi

Mentre l’India fatica a far fronte alla domanda senza precedenti di test RT-PCR, i rapporti indicano che fino al 20% dei sintomi sono Covid-19 I pazienti risultano negativi.

Questa apparente tendenza di risultati falsi negativi potrebbe negare il ricovero in ospedale e l’assistenza critica per i pazienti gravi, consentendo ai pazienti asintomatici di muoversi e diffondere il virus. La tendenza ha spinto gli esperti, incluso il direttore dell’AIIMS, il dottor Randeep Jolleria, a raccomandare il trattamento con Covid-19 a tutti i soggetti con sintomi classici, indipendentemente dai risultati della RT-PCR.

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Perché falsi negativi

I test RT-PCR, che sono il gold standard nella diagnosi di Covid-19, non sono perfetti. La sensibilità minima (capacità di rilevare i positivi) richiesta dall’Indian Council of Medical Research (ICMR) per convalidare un test RT-PCR è del 95%. Ciò significa che ci si può aspettare fino al 5% dei risultati falsi negativi.

Mentre rapporti aneddotici indicano che la quota di risultati falsi negativi è in aumento in tutta l’India, non ci sono ancora studi a sostegno di ciò.

In teoria, quattro fattori generali determinano l’accuratezza del test RT-PCR: la carica virale in una persona, la qualità della raccolta e della manipolazione del campione, l’efficacia del kit stesso e anche il criterio per l’interpretazione del test.

Carico o carico virale: Di solito, il Covid-19 appare sufficientemente entro il quinto giorno del ciclo di infezione. Se viene testato in qualsiasi momento subito dopo l’esposizione, la persona infetta può diventare Covid-negativa. Questo potrebbe non essere un fattore importante alla base del recente trend negativo negativo, poiché alcune mutazioni Covid-19 sembrano mostrare i primi sintomi.

Un certo numero di pazienti che mostravano sintomi falsi negativi nei test RT-PCR sono stati successivamente confermati Covid-positivi nei test alveolari broncoalveolari (BAL) che raccolgono campioni dal tratto respiratorio inferiore attraverso un broncoscopio. Ciò ha portato a ipotizzare che alcune delle mutazioni si estendano oltre il tratto respiratorio superiore per colpire il polmone – uno scenario che, sulla base di un campione raccolto dalle cavità nasali e della gola, potrebbe rifiutare il test RT-PCR, che è la carica virale richiesta per ottenere un risultato accurato.

Capacità di esplosione: Il numero di laboratori di analisi Covid in India è aumentato da 14 nel febbraio 2020 a oltre 2.400 nell’aprile 2021. Questa rapida espansione ha richiesto a centinaia di laboratori di approvare i test RT-PCR e di formare frettolosamente migliaia di tecnici.

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A scopo precauzionale, nel luglio 2020 ICMR ha elencato 30 laboratori di controllo qualità per verificare tutti i laboratori Covid che ha approvato. Da allora sono stati aggiunti altri 8 laboratori di controllo qualità. Tuttavia, fonti in più laboratori in tre stati hanno affermato che “solo poche ispezioni di strutture e strumenti”.

Idealmente, una miscela di campioni positivi e negativi dovrebbe essere prelevata a caso da ogni laboratorio periodicamente per ripetere il test. È già stato fatto prima? Si. È stato fatto costantemente? No “, ha detto uno scienziato dell’ICMR non autorizzato a parlare con i media.

Avvicinamento al monitoraggio periodico di laboratorio e ai dati di conformità della qualità Da luglio 2020, l’ICMR e numerosi laboratori di controllo della qualità sono rimasti in silenzio.

L’elemento umano: I test possono andare male in varie fasi: dalla cattiva raccolta e conservazione del campione all’estrazione e amplificazione sbagliate. Tutti i kit RT-PCR includono un controllo interno (IC) per la protezione da uno scenario in cui l’RNA non viene estratto / amplificato, risultando in un falso negativo. L’IC può essere esterno o interno. È esogeno quando una molecola di stampo di RNA sintetico viene aggiunta a ciascun campione prima dell’estrazione dell’RNA. Il test è considerato nullo quando l’RNA sintetico non viene rilevato dopo l’estrazione e viene prescritto un nuovo test. Il controllo interno utilizza un gene “home” presente nel campione; Non rilevarlo dopo una procedura di estrazione dell’RNA annulla il test.

“Il gene che mantiene la casa umana garantisce anche la qualità del campione … Ma più del 75% dei kit RT-PCR nel mercato indiano utilizza controlli interni esterni più economici”, ha detto un biologo molecolare di Mumbai.

Le procedure operative standard dell’ICMR dell’aprile 2020 per RT-PCR hanno confermato che il controllo di estrazione esterno “può essere ignorato in quanto non rifletterà la qualità del campione raccolto”. Consigliato “Separare RNase P o qualsiasi altro gene per la conservazione domestica … Deve essere eseguito in parallelo in una provetta separata … (per verificare) la qualità del campione raccolto” ed eseguire l’estrazione.

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Nel maggio 2020, la mega gara di ICMR / HLL per i kit RT-PCR ha stabilito requisiti simili. Un certo numero di produttori ha affermato che diverse società utilizzano diversi controlli interni, inclusi controlli esterni che sono stati approvati da organismi di regolamentazione come FDA e CEIVD, e che la selezione inversa basata sui geni della manutenzione domestica scoraggerebbe la concorrenza leale. Infine, l’offerta è stata rivista per includere opzioni interne ed esterne per il controllo interno.

Mutazione virale: Il test RTR-PCR mira a una o più regioni specifiche di uno o più geni virali per rilevarne la presenza. Il test può restituire risultati falsi negativi se si verifica una mutazione nella porzione del genoma che è stata valutata. È improbabile che i test che utilizzano più bersagli genetici, come quelli utilizzati in India, vengano ingannati dalle mutazioni.

Le agenzie di regolamentazione come la Food and Drug Administration degli Stati Uniti monitorano regolarmente l’effetto delle mutazioni sui test RT-PCR mentre esperti come il dottor Rakesh Mishra, direttore dell’Hyderabad Center for Cellular and Molecular Biology (CCMB) ritengono che l’ICMR dovrebbe iniziare un esercizio simile , potrebbe non esserlo. È facile monitorare più di 200 kit RT-PCR certificati in India contro mutazioni emergenti in tempo reale.

Per prima cosa, nessun produttore ha (o pubblicherà) le sequenze dettagliate del proprio obiettivo di test. “Durante la domanda per l’ICMR, hanno menzionato solo i geni bersaglio e non le sequenze dei primer”, ha detto un ricercatore senior presso il Ministero della Salute.

Finora, tuttavia, c’è motivo di sentirsi un po ‘fiduciosi anche quando non c’è alcun controllo dell’efficacia in tempo reale. Finora, le varianti Covid-19 contengono principalmente mutazioni nel gene S (proteina spike). La dott.ssa Shanta Dutta, direttrice del National Institute of Cholera and Enteric Diseases (NICED) a Calcutta, ha detto che la maggior parte dei gruppi qui utilizza aree target salvate (che non sono cambiate).

Crollo dei prezzi

In un anno, il prezzo del kit RT-PCR è diminuito da oltre Rs 1.100 a meno di Rs 40. Da quando l’esenzione dal dazio all’importazione è stata revocata nell’ottobre 2020, la maggior parte dei marchi stranieri ha lasciato il mercato indiano a causa di un ulteriore onere sui costi del 15%. Un certo numero di marchi indiani si è anche rifiutato di vendere per meno di 100 rupie. Molti hanno scoperto che ai clienti aziendali professionisti non importa pagare un piccolo extra per la garanzia della qualità. Alcuni offrono anche diversi kit PCR a diversi livelli di prezzo.

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Anche se nessuno lo dice ufficialmente, molti mettono in dubbio la qualità della concorrenza più economica. L’opinione contraria è che ogni kit di test disponibile sul mercato soddisfa gli standard di convalida dell’ICMR e che qualsiasi guerra dei prezzi in definitiva avvantaggia il consumatore.

Tuttavia, non tutti sono convinti. “La corrispondente diminuzione del costo dei test di laboratorio varia da Rs 4.500 a 800 rupie. Inoltre, la persona che visita il laboratorio locale per il test Covid sa quale kit viene utilizzato? Quanti laboratori spenderanno 100 rupie quando potranno utilizzare il Kit Rs-40? “, Ha detto uno dei primi produttori indiani di kit Covid PCR.

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Il Valore Ct

Il test RT-PCR amplifica il DNA estratto dal campione per rilevare il tipo specifico di virus Covid-19. L’amplificazione avviene in cicli con un valore di soglia (Ct). Ovviamente, maggiore è la presenza / carica virale, minore è il valore Ct o il numero di cicli di amplificazione necessari per renderlo rilevabile.

ICMR ha impostato il valore Ct a 35 per risultati negativi. Inoltre, qualsiasi traccia del virus potenzialmente presente è trascurabile e il campione è giudicato Covid negativo.

Ma alcuni stati come il Maharashtra hanno cercato di ampliare i limiti di accettabilità proponendo un valore Ct di 24. Poiché ciò escluderebbe un gran numero di persone con una carica virale quantitativamente bassa ma clinicamente significativa, ICMR ha ribadito la sua posizione sul valore di Ct Un valore di 35.

Tuttavia, c’è poca chiarezza se tutti gli stati seguono lo stesso standard Ct. Secondo gli amministratori delegati di almeno due delle reti di laboratori multinazionali, hanno ricevuto istruzioni verbali contraddittorie e talvolta ingiustificate su questi standard di test. Anche i test molecolari non sono immuni all’auto-bias.

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